|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Moderní metody studia protein-proteinových interakcí
Křivková, Jana ; Hrdý, Ivan (vedoucí práce) ; Kučerová, Jitka (oponent)
Protein-proteinové interakce (PPI) hrají nepostradatelnou roli ve všech procesech v živých buňkách. Pochopení interakcí mezi proteiny nám umožňuje bližší popis buněčných dějů a jejich pochopení otevírá nové možnosti i pro návrh léčiv. Důležitost otázky studia PPI se odráží v recentním rozvoji různorodých metod pro jejich identifikaci a popis. Cílem této práce je sumarizovat poznatky o nových a zdokonalených experimentálních metodách identifikace a charakterizace proteinových interakcí. Metody popsané v této práci jsou členěny do čtyř kapitol, metody blízkostí indukovaného značení proteinů (BioID, BioID2, APEX, TurboID, MiniTurbo, PUP-IT, AirID, SPPLAT, EMARS), využití síťování proteinů pro jejich identifikaci a strukturní charakterizaci (XL-MS), fluorescenční metody identifikace a vizualizace (BiFC, FRET, BRET) a biofyzikální metody pro stanovení kinetických či termodynamických parametrů interakce (SPR, ITC, MT).
|
|
|
Pokročilé metody stanovení lektin-sacharidové interakce
Červený, Jakub ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Spolehlivá a reprodukovatelná kvantifikace a podrobná charakterizace interakcí mezi biomedicínsky významným proteinem a jeho syntetickým sacharidovým ligandem může poskytnout nové informace pro návrh lepších diagnostických a terapeutických nástrojů. Vysoká citlivost a specifičnost jsou základními požadavky na proveditelnost analytické metody. Těchto parametrů může být obtížné dosáhnout u vysoce komplexních systémů, jako jsou komplexy lektin- sacharid. Na druhou stranu diagnostika a terapie na bázi sacharidů nabízí velkou výhodu detekce biologicky aktivních lektinových receptorů, které nelze dosáhnout pomocí protilátek. V této práci demonstrujeme použití techniky interferometrie na biovrstvě (BLI) ke sledování interakcí lektin-sacharid pro multivalentní systém. Pomocí funkcionalizace nového konstruktu galektinu-1 biotinylovanou značkou AVI in vivo bylo dosaženo vhodné imobilizace na biosenzoru bez ztráty lektinové aktivity. Díky vysoké citlivosti této techniky byly získány kinetické parametry interakce s připravenými multivalentními neoglykoproteiny založenými na epitopech LacNAc v rozsahu mikro- až nanomolárních KD. Komplementarita této metody byla paralelně prokázána měřením ITC a kompetitivní ELISA. Bylo zjištěno, že neoglykoprotein s nižším obsahem LacNAc má nižší KD (BLI - 230 nM; ITC - 81 nM)...
|
|
|
Studium nově objeveného proteinu GL50803_16424 u Giardia intestinalis.
Pelc, Josef ; Doležal, Pavel (vedoucí práce) ; Pyrih, Jan (oponent)
Anaerobní jednobuněčný eukaryotický organismus Giardia intestinalis je celosvětově rozšířený střevní parazit člověka a zvířat. Způsobované onemocnění giardióza je jednou z nejčastějších parazitárních infekcí ve vyspělých částech světa. G. intestinalis je také zajímavá svými unikátními buněčnými znaky. Jedním z nich je přítomnost mitosomů, speciálních organel odvozených od mitochondrií. Podobně jako mitochondrie je mitosom ohraničen dvěma membránami a má stejný způsob transportu proteinů. Nicméně mitosom nemá vlastní genom a doposud je známá pouze jedna mitosomální metabolická dráha - syntéza železo-sirných klastrů. Za použití in vivo enzymatického značení bylo identifikováno několik nových mitosomálních proteinů včetně GL50803_16424. Naši pozornost upoutal protein GL50803_16424 tím, že interagoval s proteiny všech mitosomálních subkompartmentů: vnější membránou, vnitřní membránou a matrix. Navíc exprese proteinu GL50803_16424 značeného HA tagem vedla k tvorbě neobvyklých struktur v blízkosti mitosomů, které nebyly dříve pozorovány. Bioinformatické přístupy ukázaly, že GL50803_16424 má doménu podobnou "myelodysplasia-myeloid leukemia factor 1-interacting protein". Naše data z hmotnostní spektrometrie ukazují, že protein GL50803_16424 interaguje s proteiny endoplazmatického retikula a mitosomu. Úzké...
|
|
|
Candida parapsilosis secreted aspartic proteinases: processing and secretion
Vinterová, Zuzana ; Heidingsfeld, Olga (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent) ; Szotáková, Barbora (oponent)
Candida parapsilosis je lidský oportunní patogen, jehož klinický význam vzrůstá, a který způsobuje širokou škálu potencionálně život ohrožujících infekcí u jedinců s oslabeným imunitním systémem. Jedním z nejvýznamějších virulenčních faktorů kvasinek Candida je produkce sekretovaných aspartátových proteas (Saps). Předkládaná disertační práce se zabývá převážně studiem sekretované aspartátové proteasy 1 (Sapp1p) kvasinky C. parapsilosis, jejím procesem aktivace a sekrece za různých podmínek a s využitím různých experiemntálních modelů. Sapp1p je sekretovaná buňkami C. parapsilosis do mimobuněčného prostoru se zcela odštěpeným pre-pro-peptidem a plně proteolyticky aktivní. Pokusy studující buněčnou stěnu C. parapsilosis prokázaly prodlouženou přítomnost zcela aktivované proteasy na buněčném povrchu (CW-Sapp1p). Metoda pro měření enzymové aktivity Sapp1p provedená na neporušených buňkách ukázala, že CW-Sapp1p je proteolyticky aktivní ještě před svým uvolněním do mimobuněčného prostoru a je schopná štěpit substrát. Pokusy s biotinylací a následnou analýzou pomocí hmotnostní spektrometrie ukázaly, že biotinylace CW-Sapp1p je proces saturovatelný, jehož výsledkem ale nejsou plně naznačené molekuly. Přístupnost jednotlivých lysinových zbytků byla v molekule Sapp1p proměnlivá s výjimkou čtyř zbytků, které...
|
host ::
RSS.